Metagenomic characterization, bioactive properties and biotechnological applications of the extremophilic microorganisms inhabiting Odiel saltern ponds

Abstract

Extremophilic microorganisms are those that live under the most severe conditions for life on Earth, including extreme values of temperature, pressure, pH, radiation, or salinity, among others. What is really surprising is that these microorganisms, not only tolerate, but require for their proliferation conditions which are considered lethal for most individuals. In this doctoral thesis, we focus on a specific type of extremophilic microorganisms, the so-called halophiles, living in hypersaline environments where the concentration of salt reaches ten times the salinity of the sea. These microorganisms proliferate in environments such as salt lakes, salt mines, brine, and salt mines. This work focuses on the study of the microbial population of Odiel salterns, located in the marshlands of the Odiel river in the city of Huelva (Spain). In many occasions, the microbial diversity in hypersaline environments has been underestimated due to the lack of suitable methods for its study, given that for their extremophilic nature many of these microorganisms do not proliferate well in the laboratory. However, halophiles are an excellent source of resources, as they possess specially adapted enzymes and have a large battery of metabolites to cope with the extreme conditions in which they live. In this work, a complete characterization of the microbial communities that inhabit Odiel saltern ponds is carried out, and the applications of some of the compounds produced by the isolated halophilic microorganisms are studied. Different methods for the characterization of the microbial population at extreme salinity are addressed (Chapter 1). The bioactive properties (Chapter 2) and the biotechnological applications (Chapter 3) of the metabolites from the isolated microorganisms were analyzed, to conclude with a further insight into the dynamics of the microbial diversity across the salinity gradient (Chapter 4). In Chapter 1 the characterization of prokaryotic population in the highest salinity rafts of the Odiel salterns (33% NaCl) is presented. We combined two culture-independent strategies based on molecular techniques, clone library generation, and high throughput sequencing, both focused on the coding gene of 16S rRNA. The results showed that both methods are comparable in the determination of the majority genera, although metagenomics gives more information about the minority ones. Among the most abundant microorganisms, haloarchaea of the genera Halorubrum and Haloquadratum, in addition to the bacterium Salinibacter ruber were found. On the other hand, the capacity of the biomass collected from the crystallizer pond to produce different extracellular hydrolases and halocins was assessed, and furthered in the following two chapters. In Chapter 2 the evaluation of the antioxidant, antimicrobial and bioactive properties of various extracts of two halophile archaea strains isolated from Odiel salterns is reported. These haloarchaea were phylogenetically classified as Haloarcula sp. HM1 and Halobacterium sp. HM2. The most outstanding results were found in the acetone extracts of both species, which had high antioxidant, antimicrobial, anti-inflammatory, and melanogenic capacity. In addition, aqueous extracts of both haloarchaea exhibited a considerable inhibition ability over the enzyme acetylcholinesterase, related to neurological disorders. In Chapter 3, the amylase activity of an isolated halophilic archaeon is characterized using biochemical and proteomic approaches. Amylases are one of the most widely used enzymes in the industry, where the tolerance of halophilic proteins to very extreme conditions can be of high applied interest. After a screening within different strains of isolated haloarchaea, the one with the highest amylase activity was identified as Haloarcula sp. HS. This microorganism showed amylase activity in both the cell and extracellular extract, with maxima at 60°C and 25% NaCl. Up to three different amylases of the so-called α-amylase family were identified. In addition, the effectiveness of extracellular amylase activity was tested to treat bakery residues under high salinity. Finally, in Chapter 4 the study of microbial diversity in the Odiel salterns ponds along the salinity gradient (3.5, 7.5, 15, and 30% NaCl) is described. The microbial communities of eukaryotes and prokaryotes were characterized by the massive sequencing of the 16S and 18S rRNA coding genes, together with the analysis of the most abundant pigments. It was found that green microalgae (Chlorophyta) dominate phytoplankton in all salinities and that the phylum Proteobacteria is displaced by the phyla Bacteroidetes and Euryarcheaota as salinity increases. Finally, the evaluation of the role of microbial carotenoids in the trophic chain indicated that these pigments could pass to higher organisms such as flamingos through the small crustacean Artemia.

Los microorganismos extremófilos son aquellos que viven bajo las condiciones más severas para la vida en la Tierra, incluyendo valores extremos de temperatura, presión, pH, radiación, o salinidad, entre otros. Lo realmente sorprendente es que estos microorganismos, no solo toleran, sino que requieren para su proliferación condiciones que se consideran letales para la mayoría de los individuos. Dentro de los microorganismos extremófilos, esta tesis doctoral se ha centrado en el estudio de un tipo concreto de ellos, los denominados halófilos, que habitan en ambientes hipersalinos, donde la concentración de sal llega a superar en diez veces la salinidad del mar. Estos microorganismos proliferan en lugares como lagos salados, minas de sal, salmueras y salinas. Este trabajo está centrado en el estudio de la población microbiana de salinas del Odiel, ubicadas en las marismas del río Odiel en la ciudad de Huelva (España). La diversidad microbiana en ambientes hipersalinos ha estado subestimada por la falta de métodos adecuados para su estudio, dado que por su carácter extremófilo muchos de estos microorganismos no proliferan bien en laboratorio. Sin embargo, los halófilos suponen una excelente fuente de recursos, ya que poseen enzimas especialmente adaptadas y una gran batería de metabolitos con potencial interés biotecnológico, que utilizan para hacer frente a las condiciones extremas en las que viven. En este trabajo se realiza una caracterización completa de las comunidades microbianas que habitan en las balsas de las salinas del Odiel, y se estudian las aplicaciones de algunos de los compuestos producidos por los microorganismos halófilos aislados. Se abordan distintos métodos para la caracterización de la población microbiana a salinidad extrema (Capítulo 1), seguido del análisis de las propiedades bioactivas (Capítulo 2) y aplicaciones biotecnológicas (Capítulo 3) de los metabolitos producidos por los microrganismos aislados, para concluir con el estudio de la evolución de la biodiversidad microbiana a lo largo del gradiente de salinidad (Capítulo 4). En el Capítulo 1 se presenta la caracterización de la población de microorganismos procariotas en las balsas de mayor salinidad (33% NaCl). Se combinaron dos estrategias independientes de cultivo basadas en técnicas moleculares, la generación de genotecas y la secuenciación masiva, ambas centradas en el gen codificante del ARNr 16S. Los resultados mostraron que ambos métodos son comparables en cuanto a la determinación de los géneros mayoritarios, aunque la metagenómica otorga más información sobre los minoritarios. Dentro de los microorganismos más abundantes, se encontraron haloarqueas de los géneros Halorubrum y Haloquadratum, además de la bacteria Salinibacter ruber. Por otro lado, se evaluó la capacidad de la biomasa recolectada de las balsas de cristalización para producir distintas hidrolasas extracelulares y halocinas, sobre lo que se profundiza en los dos siguientes capítulos. En el Capítulo 2 se relata la evaluación de las propiedades antioxidantes, antimicrobianas y bioactivas de diversos extractos de dos cepas de arqueas halófilas aisladas de las salinas del Odiel. Estas haloarqueas se clasificaron filogenéticamente como Haloarcula sp. HM1 y Halobacterium sp. HM2. Los resultados más destacables se encontraron en los extractos de acetona de ambas especies, los cuales presentaron alta capacidad antioxidante, antimicrobiana, anti-inflamatoria y melanogénica. Además, los extractos acuosos de ambas haloarqueas exhibieron inhibición sobre la enzima acetilcolinesterasa, relacionada con desórdenes neurológicos. En el Capítulo 3, se detalla la caracterización bioquímica y proteómica de la actividad amilasa de una arquea halófila aislada. Las amilasas son unas de las enzimas más empleadas en la industria, donde las proteínas de halófilos pueden resultar útiles al tolerar condiciones muy extremas. Tras realizar un cribado con distintas cepas de haloarqueas aisladas, se identificó la que presentaba mayor actividad amilasa como Haloarcula sp. HS. Este microorganismo mostró actividad amilasa tanto en el extracto celular como extracelular, con máximos a 60°C y 25% NaCl. Se identificaron hasta tres amilasas distintas de la familia de las denominadas α-amilasas. Además, se probó la efectividad de la actividad amilasa extracelular para tratar residuos de panadería bajo elevada salinidad. Finalmente, en el Capítulo 4 se describe el estudio de la diversidad microbiana en las balsas de las salinas del Odiel a lo largo del gradiente de salinidad (3,5; 7,5; 15 y 30% NaCl). Las comunidades microbianas de eucariotas y procariotas se caracterizaron mediante la secuenciación masiva de los genes codificantes para el ARNr 16S y 18S, junto al análisis de los pigmentos más abundantes. Se comprobó que las microalgas verdes (Chlorophyta) dominan el fitoplancton en todas las salinidades y que el filo Proteobacteria es desplazado por los filos Bacteroidetes y Euryarcheaota conforme aumenta la salinidad. Por último, la evaluación del papel de los carotenoides microbianos en la cadena trófica indicó que estos pigmentos podrían pasar a organismos superiores como los flamencos a través del pequeño crustáceo Artemia.