Aplicaciones biotecnológicas y mediambientales de la microalga Chlorella sorokiniana

Abstract

El término microalga engloba a un grupo heterogéneo de microorganismos unicelulares que realizan fotosíntesis oxigénica y que han demostrado una gran capacidad para fijar CO2 y producir O2, con una eficiencia entre 10 y 50 veces mayor que las plantas superiores. En los últimos años, han despertado un gran interés como potenciales fijadores de CO2 y productores de biocombustibles con baja huella de carbono, así como, por el aprovechamiento de su biomasa para la obtención de compuestos de alto valor añadido, que pueden ser utilizados en la industria cosmética, farmacéutica, en nutrición humana o alimentación animal. Más aún, algunas especies de microalgas pueden utilizar residuos agroindustriales como nutrientes y tolerar altas concentraciones de contaminantes, como los metales pesados, lo que las convierte en sistemas muy prometedores para procesos de bioremediación. Todos estos aspectos se revisan con detalle en un capítulo introductorio (Capítulo 1). Esta memoria de Tesis doctoral incluye además un capítulo con la descripción pormenorizada de toda la metodología utilizada (Capítulo 2) y cuatro capítulos que describen los resultados de las investigaciones realizadas utilizando la microalga clorofita perteneciente a la clase de las Trebouxiophyceae, Chlorella sorokiniana, una especie robusta y capaz de crecer con una alta tasa de crecimiento, incluso en condiciones adversas. Las investigaciones realizadas se centran en las potenciales aplicaciones biotecnológicas y medioambientales de la microalga, entre las que se incluyen su cultivo utilizando residuos industriales (Capítulo 3) o en presencia de metales pesados (Capítulo 4). Además, se ha optimizado la metodología para la modificación genética de la microalga mediante electroporación (Capítulo 5) y se ha realizado una comparativa de su perfil de aminoácidos y su valor nutricional frente al de otras 57 especies de microalgas (Capítulo 6). En las investigaciones descritas en el Capítulo 3 se muestra como la microalga Chlorella sorokiniana puede cultivarse en condiciones mixotróficas utilizando varios residuos industriales. En este capítulo también se demuestra la viabilidad de un cultivo con residuos de lías oxidadas de la industria vinícola, que resultaron ser la mejor fuente de carbono entre todas las testadas. El estudio se ha realizado en un reactor de 2 L en modo discontinuo, con concentraciones optimizadas de nutrientes, donde se obtiene una alta productividad de biomasa (11,0 g L-1) y lípidos neutros (38% DW). En el Capítulo 4 se estudia el efecto de metales pesados, como el cobre y el cadmio, y metaloides, como el arsénico en sus estados de oxidación III y V, sobre el crecimiento, la asimilación de nitrógeno y la capacidad de acumulación intracelular en Chlorella sorokiniana, siendo el cadmio el elemento acumulado en mayor cantidad. También se ha estudiado el efecto de los metales pesados sobre los niveles de expresión génica y de actividad enzimática de varias enzimas antioxidantes, tales como la ascorbato peroxidasa y la catalasa; y de enzimas de la ruta de asimilación del nitrógeno y el azufre, observándose que en general la mayor parte de estas enzimas se inducen en presencia del metal. Finalmente, se ha llevado a cabo un estudio proteómico cuantitativo que compara la expresión de diferentes proteínas de Chlorella sorokiniana en presencia y ausencia de cadmio. Este estudio muestra que diversas rutas metabólicas, como la fotosíntesis, la fosforilación oxidativa, la glucólisis, el ciclo de Krebs o la biosíntesis de proteínas ribosomales se encuentran inhibidas en presencia de cadmio. Sin embargo, otras como la fotorrespiración, las enzimas antioxidantes, la gluconeogénesis, la asimilación de nitrógeno y azufre o la biosíntesis de ciertos aminoácidos, se encuentran inducidas en las mismas condiciones. En el Capítulo 5 se describe la optimización de la transformación nuclear de Chlorella sorokiniana mediante electroporación, utilizando diferentes promotores heterólogos como el promotor CaMV 35S del virus del mosaico de la coliflor, el promotor NOS de la nopalina sintasa de Agrobactereium tumefaciens y el promotor híbrido HSP70S/RBCS2 de Chlamydomonas reinhardtii, que dirigen la expresión del gen selectivo APHVIII de resistencia al antibiótico paromomicina. Para ello se han optimizado los parámetros de la electroporación, a 2,5 kV de intensidad de campo eléctrico y 3 el número de pulsos. De entre los tres promotores utilizados, el que mayor eficiencia obtuvo en número de transformantes y mejor expresión en Chlorella sorokiniana, tanto a nivel génico como de proteínas, fue el promotor CaMV 35S. Además, se ha desarrollado un método de criopreservación a -80 °C, utilizando etilenglicol al 5% v/v como criopreservante, capaz de mantener la viabilidad celular de los transformantes obtenidos durante periodos de 365 días. Por otra parte, el en Capítulo 6 se compara el perfil aminoácidico de 57 microalgas pertenecientes a 8 phyla y 38 genera, entre las que se incluye Chlorella sorokiniana. En el estudio se incluyen tanto los aminoácidos estructurales como los aminoácidos libres. Se han determinado 17 aminoácidos mediante GC-MS, siendo mayoritarios, de manera general, glutamato/glutamina, aspartato/asparragina, alanina, leucina y lisina. Por otro lado, el phylum miozoa y las microalgas Ochromonas sp. y Chroomonas salina presentaron mayor contenido en aminoácidos esenciales y, por tanto, mayor valor nutricional. Además, se ha conseguido establecer una relación entre el perfil de aminoácidos libres y el grupo taxonómico al que pertenecen la mayoría de las especies.

The term microalga is comprised of a heterogeneous group of unicellular microorganisms that perform oxygenic photosynthesis with high capacity to fix CO2 and produce O2, their efficiency being between 10 and 50 times greater than higher plants. In recent years, microalgae have awakened interest as potential CO2 fixer organisms and producers of biofuel with a low carbon footprint. Furthermore, the uses of microalgal biomass is increasing in order to obtain high value compounds for cosmetics, pharmaceutic and human or animal nutritional industries. Moreover, some microalgae can use industrial wastewaters as nutrients or tolerate high concentrations of contaminants, such as heavy metals, subsequently creating the potential to be bioremediation systems. These applications are discussed in detail within the introductory chapter (Chapter 1). This thesis also incorporates a chapter where methodology is described (Chapter 2), and a further four chapters which describes the results obtained using the chlorophyte microalga Chlorella sorokiniana, whose class is Trebouxiophyceae. This microalga not only has a high growth rate, but also is a robust species able to grow under adverse conditions. The studies deepen in the biotechnological and environmental applications of this microalga, including its cultivation with industrial wastewaters (Chapter 3) and heavy metals (Chapter 4). Additionally, the optimization of a genetic modification method through electroporation (Chapter 5), and a comparative between Chlorella sorokiniana and other 57 microalgae relating to amino acids profile and nutritional value (Chapter 6) has been performed. The research described in Chapter 3 shows that the microalga Chlorella sorokiniana can grow in mixotrophic cultures using different industrial wastes. In this chapter, a fed-batch 2 L bioreactor using wine waste lees, and the optimal concentration of nutrients previously selected, was developed, and used to get a high productivity in biomass (11.0 g L-1) and neutral lipids (38% DW) terms. In Chapter 4 the effect that heavy metals, such as copper and cadmium, or metalloids, such as arsenic (III and V), produced in Chlorella sorokiniana was evaluated. The parameters studied were growth, nitrogen assimilation and intracellular accumulation that Chlorella sorokiniana has relating to these heavy metals and metalloids, being the microalga a high cadmium accumulator. Moreover, the effect that these heavy metals produce in gene expression and enzymatic activity levels in different antioxidant enzymes, such as ascorbate peroxidase and catalase, or enzymes involved nitrogen and sulphur assimilation, have been tested, showing a general upregulation for most of these enzymes. Finally, a quantitative proteomic approach that compares the expression of Chlorella sorokiniana proteins with or without cadmium in the culture media was performed. The results enable us to conclude that different metabolic pathways, such as photosynthesis, oxidative phosphorylation, glycolysis, TCA cycle or ribosomal proteins biosynthesis are downregulated with cadmium in the culture medium. However, other pathways, such as photorespiration, antioxidant enzymes, gluconeogenesis, nitrogen and sulphur assimilation or biosynthesis of some amino acids are upregulated under the same conditions. In Chapter 5 the optimization of an electroporation method for nuclear transformation in the microalga Chlorella sorokiniana is described. For this method, different heterologous promoters, such as the CaMV 35S promoter of cauliflower mosaic virus, the nopaline synthase promoter, NOS, from Agrobacterium tumefaciens, and the hybrid promoter HSP70S/RBCS2 from Chlamydomonas reinhardtii were tested. These promoters direct the expression of the resistance paromomycin gene APHVIII. The most suitable electroporation parameters were 2.5 kV of electric field strength and 3 electric pulses. The most efficient promoter for Chlorella sorokiniana is the CaMV 35S promoter, showing higher number of transformants and higher gene and protein expression. Additionally, a cryopreservation method, at -80 °C, using ethylene glycol 5% v/v as cryopreservant and able to guarantee cell viability of transformants over 365 days, was developed. Finally, in Chapter 6, the aminoacidic profile of 57 microalgae belonging to 8 phyla and 38 genera, including Chlorella sorokiniana, is compared. This study includes structural and free amino acids. 17 amino acids were determined by GC-MS, being the most common in almost all the species glutamate/glutamine, aspartate/asparragine, alanine, leucine and lysine. Moreover, miozoa, as phylum, and Ochromonas sp. and Chroomonas salina, as species, showed higher essential amino acids content and, consequently, the highest nutritional value. Furthermore, a dependence between free amino acids profile and taxonomic groups was stablished for most of the microalgae.