El cáncer de pulmón (CP) constituye una de las muertes más comunes
por neoplasia en el mundo provocando más de 1.300.000 muertes al año. La
supervivencia a 5 años comprende un 65% cuando la enfermedad se
diagnostica en estadios precoces, disminuyendo a un 10% cuando se
encuentra en estados avanzados. Por ello, la búsqueda de biomarcadores
capaces de detectar de forma precoz el CP, así como capaces de evaluar la
progresión del mismo, constituye un importante reto en medicina. En este
sentido, las metodologías ómicas son herramientas de análisis muy poderosas
que permiten determinar un gran número de moléculas, como metabolitos,
proteínas o metales unidos a proteínas. Estas biomoléculas pueden sufrir
alteraciones en respuesta a una enfermedad, por lo que podrían servir como
marcadores de diagnóstico. Así, en esta Tesis Doctoral se han aplicado tres
metodologías ómicas (metabólomica, ionómica y metalómica), basadas en la
espectrometría de masas, a muestras biológicas humanas de pacientes con
cáncer de pulmón, con el objetivo de identificar biomoléculas alteradas en
esta enfermedad que puedan servir como biomarcadores.
Con el fin de abarcar una mayor cobertura de metabolitos se optimizó
una plataforma metabolómica “no dirigida” basada en dos técnicas analíticas:
la cromatografía de gases (GC-MS) y la infusión directa (DI-MS) acopladas a
espectrometría de masas (MS). Esta plataforma fue aplicada a muestras de
pacientes con CP, pacientes control y pacientes con diversas enfermedades
pulmonares no cancerosas como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica,
EPOC. Las muestras empleadas en el estudio fueron muestras de suero
sanguíneo, de orina, y como principal novedad del estudio, muestras de
lavado broncoalveolar (LBA), de las que no había antecedentes en bibliografía. Para ello, los perfiles metabolómicos de pacientes con CP se
compararon estadísticamente con los de personas sanas empleando el análisis
multivariante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) para encontrar
metabolitos diferentes de forma significativa entre los grupos. El análisis PLSDA
también fue aplicado para comparar la existencia de metabolitos alterados
en pacientes con EPOC y evaluar su posible relación con el CP. Así mismo, se
evaluó la diferenciación metabolómica entre estadios tempranos y avanzados
de la enfermedad.
Por otro lado, se desarrolló una metodología ionómica basada en ICPQQQ-
MS para la determinación multielemental en muestras de suero, orina y
LBA con el fin de evaluar la distribución de oligoelementos y metales tóxicos
en CP. Además, a las muestras de suero sanguíneo se les aplicó un método de
fraccionamiento para la separación de la fracción de alta (HMM) y baja
(LMM) masa molecular y determinar la concentración de elementos en cada
fracción. Finalmente, se desarrolló una metodología metalómica basada en la
técnica de dilución isotópica por ICP-QQQ-MS para determinar la
concentración de 3 selenoproteínas importantes presentes en suero: glutatión
peroxidasa (eGPx), selenoproteína P (SELENOP) y selenoalbúmina (SeAlb).
Esta metodología también permitió la separación de moléculas pequeñas de
selenio.
De esta forma, la aplicación de estas plataformas metabolómicas,
ionómicas y metalómicas en diferentes muestras biológicas de pacientes con
CP, han permitido estudiar la alteración de metabolitos, metales y
biomoléculas de selenio asociadas al CP aportando nuevas contribuciones a la
patología de esta enfermedad.
Lung cancer (LC) is one of the most common deaths from neoplasia in
the world, causing more than 1,300,000 deaths per year. The 5-year survival
comprises 65% when the disease is diagnosed in early stages, decreasing to
10% in advanced stages. Therefore, the search for biomarkers capable of early
detection of LC, as well as capable of evaluating its progression, is a challenge
of great interest in medicine. In this sense, omics methodologies are very
powerful analysis tools that allow determining a large number of molecules
(metabolites, proteins, metals bound to proteins). These biomolecules can
undergo alterations in response to a disease, so they could serve as diagnostic
markers. Thus, in this Doctoral Thesis, three omics methodologies
(metabolomics, ionomics and metallomics) based on mass spectrometry have
been applied to human biological samples of patients with lung cancer in
order to identify altered biomolecules in this disease that can serve as
biomarkers.
In order to achieve greater metabolite coverage, a "non-target"
metabolomic platform was optimized based on two analytical techniques: gas
chromatography (GC-MS) and direct infusion (DI-MS) coupled to mass
spectrometry. This platform was applied to samples of patients with LC,
control patients and patients with various non-cancerous lung diseases such
as chronic obstructive pulmonary disease COPD. The samples used in the
study were samples of blood serum, urine, and as the main novelty of the
study, samples of bronchoalveolar lavage (BAL), of which there was no
background in the literature. Therefore, the metabolic profiles of LC patients
with those of healthy people were compared statistically by means of the
multivariate analysis of partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) in order to find significantly different metabolites between the groups. The
PLS-DA analysis was also applied to compare the occurrence of altered
metabolites in patients with COPD and evaluate their possible relationship
with LC. Likewise, the metabolomic differentiation between early and
advanced stages of the disease was evaluated. On the other hand, an ionomic
methodology based on ICP-QQQ-MS was developed for multielemental
determination in samples of serum, urine and BAL in order to evaluate the
distribution of trace elements and toxic metals in LC. In addition, serum
samples were subjected to a fractionation method for the separation of the
high fraction (HMM) and low fraction (LMM) molecular mass and determine
the concentration of elements in each fraction. Finally, a metallomic
methodology based on the isotope dilution technique by ICP-QQQ-MS was
developed to determine the concentration of 3 important selenoproteins
present in serum: glutathione peroxidase (eGPx), selenoprotein P (SELENOP)
and selenoalbumin (SeAlb). This methodology also allowed the separation of
low molecular mass species of selenium.
Thus, the application of these metabolomic, ionomic and metallomic
platforms in different biological samples from patients with LC has allowed
the study of the alteration of metal metabolites and selenium biomolecules
associated with LC disease, giving place to new contributions to the
pathology of this disease.
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