Micropropagación de

Abstract

El espectacular descenso de la masa forestal de Quercíneas producido en la zona mediterránea desde el último tercio del siglo XX, ha levantado una enorme preocupación sobre la conservación de las dehesas y bosques de Quercus, de vital importancia en dicha zona. Fruto de ello es que los numerosos estudios llevados a cabo, han permitido asociar a varios factores causales, de manera que actualemente se mantiene la hipótesis de que la acción combinada de estos factores, origina el deterioro progresivo y generalizado del árbol hasta causar su muerte, por lo que a esta enfermedad se le ha denominado como “el decaimiento” de los Quercus, considerando al patógeno Phytophthora cinnamomi como el principal factor contribuyente de esta enfermedad. Uno de los recursos para actuar frente a ésta, son los estudios de resistencia/tolerancia encaminados a la selección y propagación de individuos élite, dentro de los cuales se enmarca el presente trabajo, centrado concretamente en la selección y propagación de encinas (Q. ilex L., ssp. ballota) y alcornoques (Q. suber L.). La propagación se ha llevado a cabo mediante cultivo in vitro, ya que este método de regeneración permiten salvar los inconvenientes originados por las condiciones geográficas, climáticas y de tiempo de producción, gracias a que se realizan en condiciones ambientales muy controladas. En el primer capítulo, se ha abordado la micropropagación de material adulto y juvenil, tanto de encinas como de alcornoques. En la fase de preparación del material se observó un comportamiento diferente de ambas especies respecto al pre-tratamiento en frío de estacas de material adulto, no siendo recomendable para encina y sí para alcornoque. En la fase de implantación, las formulaciones de medios de cultivo basadas en las sales GB5 mostraron los mejores resultados en encina respecto a las GD o MS, mientras que en alcornoque, se impusieron las GD frente a las MS. En la fase de multiplicación, ya solo para el caso de los alcornoques, los explantes cultivados con sales MS mostraron mejor comportamiento que con sales GD. La mejor combinación de hormonas fue de 0,3mg/L de BAP + 2mg/L de AIB, resultando novedoso que los explantes presentaran mejor desarrollo y aspecto estando las auxinas en mayor proporción que las citoquininas. En la fase de enraizamiento, concentraciones de AIB superiores a 4mg/L, originaron problemas de necrosis apical, siendo esta causa muy dependiente del genotipo y origen del material. Porcentajes de hasta el 80% de brotes enraizados viables se lograron con el tratamiento de 4mg/L de AIB durante 15 días. Ni el tratamiento previo en oscuridad, ni en medios libres de hormonas, lograron mejorar los porcentajes globales de enraizamiento, aunque en algunos clones como el HEE-6 se llegó a alcanzar el 100% de brotes enraizados con el tratamiento en oscuridad durante los 7 primeros días de la rizogénesis. No obstante, el tratamiento en medio libre de hormonas previamente a la inducción de la rizogénesis en medios con auxinas, logró disminuir los porcentajes globales de la necrosis apical. En el segundo capítulo, se abordó la inoculación in vitro con Phytophthora cinnamomi de explantes de alcornoque y, la evaluación de parámetros representativos de la afección provocada por la infección en las plántulas inoculadas. Tras establecer la dosis de inóculo y el tiempo de inoculación adecuados para los ensayos, se pudieron establecer qué parámetros del estado sanitario de las plantas podían reflejar mejor los efectos de la infección tanto en la parte aérea como radical de las plántulas y, se compararon 5 clones de alcornoque por su diferente comportamiento frente a la infección respecto a esos parámetros. Así, parámetros de la parte aérea como el “tiempo en alcanzar la necrosis total”, “tiempo en aparecer los primeros síntomas de necrosis”, “velocidad en alcanzar la necrosis total desde la aparición de los primeros síntomas” o la “valoración visual del tallo” y, parámetros de la zona radical como el “porcentaje de longitud de raíz necrosada respecto a la longitud total”, “la tasa de crecimiento en longitud de las raíces” o la “tasa de crecimiento en número de las raíces”, actuaron como parámetros diferenciadores entre genotipos de las plántulas enraizadas in vitro e inoculadas con Phytophthora cinnamomi.

The dramatic fall in Quercinea forests occurred in the Mediterranean area from the last third of the twentieth century, has generated great preoccupation about the “dehesa” and Quercus forest conservation, because its importance in that area. Numerous studies have allowed relate the factors involved in the aforementioned fall, so the hypothesis remaining today is that the combined action of these factors, leads to the progressive and widespread deterioration of the tree up to cause its death. That is why this disease was known as oaks "decline", considering the pathogen Phytophthora cinnamomi as the main contributor to this disease. One of the resources to respond to this problem, are the studies of resistance/tolerance for selection and propagation of elite trees, within which is framed the present work, specifically focusing on the selection and propagation of holm oak (Q. ilex L. , ssp. ballota) and cork oak (Q. suber L. ). The propagation has been carried out by in vitro culture, since this method of regeneration allows saving the disadvantages caused by geographical and weather conditions, as well as time of production, in very controlled environmental conditions. The first chapter deals with micropropagation of adult and juvenile material were made, both of holm and cork oaks. In the initial phase of the material, a different behavior of both species was observed with respect to the cuttings pre-cold treatment in adult material, not being recommended for holm oak but just for cork oak. In the establishment phase, the culture media based on GB5 salts showed the best results in holm oak respect to GD or MS media, while GD rinsed better results than MS in cork oak. In the proliferation phase, only performed for cork oak, explants showed better aspect and multiplication rates in MS in opposition to GD. The best hormones combination was 0,3mg/L BAP + 2mg/L AIB, being novelty the better aspect and development of the explants remaining the auxins in greater proportions than cytokines. Rooting was performed only for cork oak too. Percentages of up to 80% of available rooted shoots were achieved with the treatment of 4mg/L of AIB for 15 days. Neither the darkness pre-treatment, nor free-hormone media treatments, improved the overall percentages of rooting, although some clones as the HEE6 reached 100% of available rooted shoots with darkness treatment during the first 7 days of rhizogenesis. Tips necrosis problems were cause by concentrations of AIB higher than 4mg/L, being this cause very dependent on the genotype and origin of the material. However, treatment in free-hormone media prior induction of rhizogenesis in auxins media, reduced the overall percentages of the tip necrosis. In the second chapter, the in vitro inoculation with P. cinnamomi of in vitro rooted explants of cork oak was made, as well as the evaluation of parameters representing the symptoms caused by infection in those plantlets. Dose of inoculum, time of inoculation for the appropriate tests and the better parameters reflecting the health state of the plants after infection in both the aerial and the radical part of plantlets were established. After that, 5 clones of cork oak were compared by its different behavior after infection with P. cinnamomi. Parameters as the "time to reach the total necrosis", "time to appear the first symptoms of necrosis", "speed to reach the total necrosis from the emergence of the first symptoms" and the "visual rating of stem" of the aerial part, and parameters as the "percentage of necrotic root length compared to the total length", "the rate of growth in length of the roots" and the "rate of growth in the number of roots" of the root zone, showed differences between genotypes of the in vitro rooted and inoculated plantlets.