El aumento cada vez más importante de una gran variedad de contaminantes químicos en el medio ambiente supone un riesgo para la salud de los organismos que habitan en él y los correspondientes ecosistemas. Los estudios de monitorización medioambiental de los ecosistemas se llevan a cabo mediante análisis químico de contaminantes convencionales como los metales (por ejemplo, Cd, As, Pb, Hg, etc.), contaminantes orgánicos (p.ej. plaguicidas, PCBs, PAHs), y contaminantes emergentes (p.ej. disruptores endocrinos, productos farmacéuticos, productos para el cuidado de la salud y detergentes) y, más recientemente, las nanopartículas. Sin embargo, estos análisis químicos tradicionales no permiten conocer el efecto que los contaminantes químicos presentes en el medio ambiente provocan sobre los organismos. Por ello, en los últimos años se han desarrollado una serie de metodologías que permiten evaluar la respuesta biológica de determinados organismos utilizados como bioindicadores de contaminación ambiental, ya que estos reflejan el efecto de los contaminantes sobre el metabolismo celular y la homeostasis global. Entre estas metodologías se encuentran el uso de biomarcadores, que se definen como parámetros bioquímicos medidos en los organismos expuestos (bioindicadores) los cuales permiten identificar, al alterarse sus niveles, la presencia de factores externos de riesgo, como por ejemplo: la presencia de sustancias tóxicas, sus efectos biológicos o los riesgos de su presencia en los ecosistemas. Además, esta respuesta puede evaluarse mediante experiencias, con bioindicadores de vida libre, que integren los procesos de sinergismo/antagonismo entre contaminantes y la interacción con sustancias de los ecosistemas, o de laboratorio, que permitan el estudio aislado del efecto de uno o más contaminantes seleccionados.
Durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral se han llevado a cabo diferentes estudios –ómicos para la búsqueda de biomarcadores de estrés medioambiental, tanto en organismos que habitan en sistemas estuáricos, como el bivalvo Scrobicularia plana; u organismos del medio terrestre, como el ratón de vida libre Mus spretus, y su equivalente genético el ratón de laboratorio Mus Musculus.
Entre los experimentos de exposición llevados a cabo durante el desarrollo de esta Tesis, se encuentran el estudio del efecto de determinadas experiencias de exposición en ratones Mus musculus y Mus spretus a elementos tóxicos como el Cd, o contaminantes orgánicos como el DDE, administrados conjuntamente con el Se, que permite evaluar el posible efecto antagonista de este elemento respecto a dichos contaminantes. Además, se han realizado experiencias de exposición en ratones Mus musculus a cócteles de metales, como As, Cd y Hg, con el fin de evaluar los efectos tóxicos de los mismos de manera conjunta así como el efecto antagónico del selenio. Asimismo, se han evaluado alteraciones en el nivel de determinadas biomoléculas de arsénico tras la exposición del bivalvo Scrobicularia plana a este elemento. Por último, se ha estudiado la respuesta biológica de dicho bivalvo al estrés medioambiental en el estuario de Río Guadalquivir.
Entre las metodologías analíticas empleadas, pueden citarse diversos procedimientos metalómicos, proteómicos y metabolómicos, todas ellas orientadas a la búsqueda de biomarcadores de contaminación ambiental en los bioindicadores citados anteriormente. Los métodos analíticos desarrollados en esta Tesis se basan en el empleo de la espectrometría de masas orgánicas e inorgánicas como técnica de detección, debido a su amplio rango de aplicabilidad, sensibilidad y selectividad.
Los estudios metalómicos, se han basado en el acoplamiento de la cromatografía líquida (HPLC) y la espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS), que permite determinar la alteración de los perfiles de determinadas biomoléculas tras la exposición a contaminantes. Además, para evaluar los cambios en el proteoma de los organismos bioindicadores, tras la exposición a contaminantes, se empleó el acoplamiento nanocromatografía líquida espectrometría de masas en tándem (nanoLC-MS/MS), técnica que se ha convertido en una herramienta esencial en el campo de la proteómica debido a su mayor sensibilidad respecto al acoplamiento LC-MS/MS convencional, permitiendo el análisis de mezclas de péptidos en pequeñas cantidades de muestras. Finalmente, se han aplicado metodologías metabolómicas en la búsqueda de metabolitos que puedan ser utilizados como biomarcadores de contaminación ambiental. Generalmente, se han empleado técnicas metabolómicas complementarias, incluyendo procedimientos no dirigidos basados en el screening de moléculas alteradas mediante infusión directa a un espectrómetro de masas de alta resolución (DI-ESI-Q-TOF-MS) y el análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), para la determinación de moléculas de menor masa molecular, que permite tener un perfil más exhaustivo de las alteraciones que sufre el metaboloma como consecuencia de la acción de los contaminantes. El análisis por infusión directa ha mostrado un gran potencial, gracias a su reducido tiempo de análisis y su simplicidad instrumental, aunque la combinación con GC-MS ha permitido identificar nuevos biomarcadores de contaminación ambiental.
Las metodologías analíticas aplicadas en este estudio proporcionan información sobre la respuesta biológica de estos organismos modelo a la contaminación, a través de los cambios de expresión de determinadas biomoléculas como consecuencia de la exposición a los contaminantes. Además, los estudios realizados han permitido profundizar en el conocimiento relacionado con el tráfico de metales, interacciones entre ellos y homeostasis en estos organismos modelo.
The increasing levels of a growing variety of chemical pollutants in the environment represent a health risk for the exposed organisms as well as for the ecosystems in which they live. Traditionally, the environmental monitoring studies of the ecosystems have been carried out by chemical analysis of conventional pollutants such as toxic trace elements (i.e. Cd, As, Pb, Hg.), organic contaminants (i.e. pesticides, PCBs, PAHs), emerging pollutants (i.e. endocrine disruptors, pharmaceuticals, health care products and detergents) and, more recently, nanoparticles. However, the biological response of an organism against pollutants can not be evaluated with these traditional chemical analyses. For all these reasons, different methodologies have been developed in recent years that allow evaluating the biological response of certain model organisms used as bioindicators against environmental contamination, since they reflect the effect on cellular metabolism and global homeostasis. Among these methodologies we can be highlighted the use of biomarkers, which can be defined as biochemical parameters measured in exposed organisms (bioindicators) that allow identifying, due to their altered levels, the presence of external risk factors, such as the presence of toxic substances. For this purpose free-living organisms are used, which integrate the synergism/antagonism between pollutants and the interaction with other substances present in the ecosystem, alternatively laboratory exposure experiments can be applied, which integrates the effect of one or more selected contaminants.
In this Doctoral Thesis, different -omics methodologies have been applied in the search of biomarkers of environmental stress, both in organisms from estuarine ecosystems, such as the bivalve Scrobicularia plana; or terrestrial bioindicators, as the free-living mice Mus Spretus and the laboratory mice Mus Musculus.
Among the exposure experiments performed under controlled laboratory conditions can be cited those with Mus musculus and Mus spretus mice with some toxics, such as Cd and DDE, administered together with Se to evaluate its possible antagonistic effect. In addition, exposure experiments to metal cocktails, such as As, Cd and Hg, have been carried out in Mus musculus mice, in order to assess the toxic effects of these metals together and the protective effect of selenium. Alterations in the levels of arsenic biomolecules have also been evaluated after the exposure of inorganic As in the bivalve Scrobicularia plana; and finally, free living bivalves were studied in the estuary of Guadalquivir river to evaluate the environmental stress in this area.
Metallomic, proteomic and metabolomic approaches are the analytical techniques used in these studies to look for biomarkers of environmental pollution using the above mentioned bioindicators. All analytical methods developed in this Thesis are based on the use of mass spectrometry as a detection technique, due to its wide range of applicability, sensitivity and specificity.
The metallomic studies have been carried out using liquid chromatography (HPLC) coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) to determine altered profiles of some biomolecules after exposure to pollutants. On the other hand, nano liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (nanoLC-MS / MS), has become an essential tool in proteomics due to its greater sensitivity with respect to conventional LC-MS/MS as it allows the analysis of mixtures of peptides in small amounts of samples. For this reason, it was used to evaluate changes in the proteome of bioindicators after exposure to several contaminants. Finally, in order to get a comprehensive analysis of biomarkers of environmental pollution, metabolomic analysis was carried out. To this end, complementary metabolomic techniques were used, including screening procedures based on direct infusion mass spectrometry (DI-ESI-MS) and gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), for the determination of low molecular mass metabolites. Direct infusion analysis showed a great potential for metabolomic studies, due to its reduced analysis time and its instrumental simplicity, but the combination with GC-MS allowed the identification of new biomarkers of environmental pollution.
The analytical methodologies applied in this PhD Thesis allow us to deep insight into the biological response of these model organisms against contamination, that is, to understand the changes in the expression of certain biomolecules as a consequence of the exposure to certain pollutants. In addition, the studies conducted clarify several biological processes such as metals traffic, interactions between them and homeostasis, which take place in these organisms.
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